Biotin Hydrazide  生物素酰肼

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Biotin Hydrazide；Sulfo-NHS；Sulfo-SMCC；Biotin-LC-Hydrazide；糖蛋白（Glycoproteins）；糖脂（Glycolipids）；CAS NO：66640-86-6； 

产品信息

产品描述

生物素酰肼（Biotin Hydrazide）是一种生物素化衍生物，用于标记表面官能、生物活性分子（比如：抗体，凝集素，糖，核酸，或含羧基或酮基的分子）[1]。生物素酰肼用作一种确定蛋白质羰基化的探针，羰基化是由活性氧或脂质氧化产物引起的一种不可逆的蛋白质翻译后修饰[2]。生物素酰肼的反应是直接进行的，不需要催化剂或还原剂。

生物素酰肼的特点：

j 糖蛋白标记：生物素化唾液酸残基处的糖基化蛋白，以便使用链霉素亲和素探针或树脂进行检测或纯化；

k 细胞表面标记：生物素化并分离细胞表面糖蛋白；

l 醛反应性：与糖基的高碘酸盐氧化作用形成的醛发生反应；

m 酰肼活化：在pH 4-6的缓冲液（如：醋酸钠）中进行反应

n 不可逆：形成永久性腙键，间隔臂不能被裂解。

o 溶解度：通常先溶于DMSO，之后在缓冲溶液中进一步稀释。

产品特性

保存与运输方法

保存：2-8℃密封避光干燥保存，长期不用亦可放到-20℃密封避光干燥保存，至少1年稳定。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 在氧化和生物素化的步骤中，都需避免使用含Tris或其他伯胺的缓冲液，因这些组分会与醛基反应，从而淬灭与酰肼的反应.

2） 酰肼与羰基的反应在不含胺基、中性条件下（pH 6.5-7.5）最有效。羰基可能存在于多糖的还原端。为了生成更多的羰基，使用特异性的氧化酶（比如：半乳糖氧化酶）或1-10mM的高碘酸钠（NaIO4）。高碘酸钠的氧化在酸性条件（比如：100mM醋酸钠，pH 5.5）下最有效，即使也能在中性缓冲液（比如：磷酸盐溶液）中反应。如果在酸性条件下完成氧化步骤，需通过透析或凝胶层析的方式进行缓冲液置换，以获得最佳的酰肼反应条件。

3） EDC介导的反应通常在MES缓冲液（pH 4.5-5）中进行。避开含伯胺（比如：Tris、甘氨酸等）的缓冲液或羧基（醋酸盐、柠檬酸盐等），这些都会淬灭反应。磷酸盐缓冲液是次优选择，因它们会降低偶联效率，即使通过添加更多的EDC能克服这一缺陷。

4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、生物素酰肼标记糖蛋白

生物素酰肼最常见的应用就是与醛基和酮基反应，特别适用于生物素化糖蛋白、多糖和其他含碳水化合物的分子。这一反应使得生物素上的酰肼基团和目标分子上的羰基基团（醛或酮）反应，形成一稳定的腙键。

这一反应的起始步骤通常需将糖残基上的顺式二醇（cis-diol）氧化生成醛基，在温和的氧化剂比如：高碘酸钠（NaIO4）辅助下。新生成的醛基立即与生物素酰肼反应。

1.1 需要材料

j 生物素酰肼储存液：比如：25mg生物素酰肼（Mw：258.34）溶于1.9354ml高质量无水DMSO，充分溶解，即得到：50mM的储存液。

k 氧化缓冲液：100mM醋酸钠缓冲液（pH 5.5）

l 高碘酸钠溶液：20mM高碘酸钠溶于氧化缓冲液。于使用前在琥珀瓶或其他避光的容器内配制该溶液。

m 偶联缓冲液：100mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.2（PBS）或其他中性或微碱、不含胺基的缓冲液

n 糖蛋白溶液：2mg/ml糖蛋白溶于氧化缓冲液

o 透析盒（透析管）或脱盐柱

1.2 反应流程

j 将1ml冰高碘酸钠溶液加入1ml冰糖蛋白溶液，混匀后，于冰上或4℃避光孵育30min。

【注】：为了仅特异性氧化唾液酸基团，加50µl高碘酸钠溶液到1ml冰糖蛋白溶液，使其终浓度为1mM。

k 通过透析或凝胶过滤（脱盐柱）的方法去除多余的高碘酸钠，并将样本缓冲液置换成偶联缓冲液，即得到：纯化的氧化糖蛋白溶液。

l 取1份生物素酰肼储存液（50mM）到9份氧化糖蛋白溶液（使得生物素酰肼的浓度为5mM）；室温（20-25℃）避光孵育2h-过夜，保持低速震荡。

【注】：根据特定的糖蛋白和预期的标记效率来优化生物素酰肼浓度和反应时间。

m 通过透析或凝胶过滤（脱盐柱）的方法去除过量未反应的生物素酰肼，生物素化蛋白可能用与非生物素化样本相同的方式来保存。

二、生物素酰肼标记羧基（通过EDC介导）

生物素酰肼也能用于偶联含羧基（-COOH）的分子（比如：蛋白和多肽），通过水溶性的碳二亚胺（比如：EDC或EDAC）。EDC活化羧基，使其能与酰肼上的伯胺反应。

反应流程：EDC活化羧基生成一活跃的中间产物-O-酰基异脲（O-acylisourea），这一中间产物之后与生物素酰肼上的胺基反应形成一稳定的酰胺键。

2.1 需要的材料

j 生物素酰肼储存液：比如：25mg生物素酰肼（Mw：258.34）溶于1.9354ml高质量无水DMSO，充分溶解，即得到：50mM的储存液。

k MES缓冲液：100mM MES醋酸钠缓冲液（pH 4.7-5.5）

l EDC溶液：100mg/ml EDC溶于MES缓冲液（~0.5M EDC溶液），需在

m 透析盒（透析管）或脱盐柱

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